Мультсериал основывается на оригинальных комиксах Питера Лэрда и Кевина Истмэна. В отличие от «Черепашек-ниндзя» 1987 года, сюжет этого сериала ближе комиксам Mirage Comics и рассчитан на другую аудиторию. На смену сказочному и фарсовому сюжету приходит более серьезное повествование, глубже раскрываются личности героев.

Приключения черепашек разворачиваются на фоне улиц Нью-Йорка, феодальной Японии, а также в альтернативной реальности, космосе и загадочном киберпространстве. Первые сезоны посвящены борьбе черепашек против заклятого врага Шреддера, позже появляются другие антагонисты. В четвертом сезоне история достигает драматического накала, после чего сюжет становится менее жестким с акцентом на юмор.

Героям предстоит спасти своего учителя Сплинтера, предотвратить разрушение вселенной, противостоять планам межпланетных врагов и тайных правительственных структур. В мультсериале раскрываются темы дружбы и взаимовыручки, поднимаются конфликты борьбы за лидерство, рассматриваются вопросы морали и чести.